幾種蛋白質含量測量方法比較
來源: 本站 類別:實用技術 更新時間:2010-08-31 閱讀次
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幾種蛋白質含量測量方法比較
蛋白質含量測定一直是生物化學中最常用、最基本的分析方法之一。蛋白質是生命的物質基礎,沒有蛋白質就沒有生命。機體每個係統都有蛋白質的參與,蛋白質占人體重量的16.3%。人體的蛋白質主要來源於食物:豆製品、肉類或者奶粉等副食品。既然蛋白質都來自於食物,那麼測定食物中的蛋白質含量就變得很有必要。
蛋白質含量測定有好多種方法,歸納起來為:凱氏定氮法、雙縮尿法、Folin酚試劑法、紫外吸收法和考馬斯亮藍法。不同的方法,原理、步bu驟zhou和he實shi驗yan試shi劑ji都dou各ge不bu相xiang同tong,但dan是shi一yi直zhi以yi來lai,凱kai氏shi定ding氮dan法fa最zui為wei經jing典dian,使shi用yong最zui為wei廣guang泛fan。近jin幾ji年nian,根gen據ju蛋dan白bai質zhi測ce定ding的de凱kai氏shi定ding氮dan法fa,很hen多duo廠chang家jia已yi研yan製zhi出chu了le相xiang應ying的de儀yi器qi,如ru:蛋白質測定儀。蛋白質測定儀測出的蛋白質含量,包括其他非蛋白含氮化合物,如遊離氨基酸、尿素等物質,因此該儀器有時又被叫做粗蛋白測定儀。
下麵我們列表來對各種蛋白質含量測定方法進行比較。
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方法 |
靈敏度 |
時間 |
原理 |
幹擾物質 |
說明 |
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凱氏定氮法 |
靈敏度低,使用於0.2-1.0mg氮,誤差為±2% |
費時,8-10小時,但如果采用凱氏定氮儀,縮短時間至4個小時 |
將蛋白氮轉化為氨氣,然後用酸吸收滴定 |
非蛋白氮(可用三氯乙酸沉澱蛋白質而分離) |
用於標準蛋白質含量的準確測定,幹擾少,如果采用凱氏定氮儀,就會大大縮短定氮時間 |
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雙縮尿法 |
靈敏度低,1-20mg |
中速20-30分鍾 |
多肽鍵+堿性Cu2+紫色絡合物 |
硫酸銨:Tris緩衝液,某些氨基酸 |
用於快速測定,但不靈敏,不同蛋白質顯色相似 |
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Folin酚試劑法 |
靈敏度高,<5微克 |
慢速40-60分鍾 |
雙縮尿反應,磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 |
硫酸銨,Tris緩衝液,甘氨酸,各種硫醇 |
耗費時間長;操作要嚴格計時;顏色深淺隨不同蛋白質變化 |
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紫外吸收法 |
較為靈敏,50-100微克 |
快速5-10分鍾 |
蛋白質中的絡氨酸和色氨酸殘基在280nm處德 光吸收 |
各種嘌呤和各種核苷酸 |
用於層析柱流出液的檢測,核酸的吸收可以校正 |
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考馬斯亮藍法 |
靈敏度最高,1-5微克 |
快速5-15分鍾 |
考馬斯亮藍染料與蛋白質結合時,其λmax由465nm變為595nm |
強堿性緩衝液,TritonX-100SDS |
最好的方法,幹擾物質少,顏色穩定,顏色深淺隨不同蛋白質變化 |
由上表可知,考馬斯亮藍法和Folin酚試劑法靈敏度最高,比紫外吸收方法高10-20倍。凱氏定氮法雖然比較複雜,但是精確度較高,因此作物蛋白質測定的標準方法,而蛋白質測定儀的發明,更是推動了凱氏定氮法的發展。我們在選擇何種方法測定蛋白質含量時,應該根據實際情況,從下麵幾個點考慮:1.實驗堆測定所要求的靈敏度和精確度。2.蛋白質的性質3.溶液中存在的幹擾物4.測定時間。從以上四個方麵綜合考慮,最後選擇最合適的測定方法。
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