含han氮dan有you機ji物wu與yu濃nong硫liu酸suan共gong熱re
，被bei氧yang化hua成cheng二er氧yang化hua碳tan和he水shui

，而er氮dan則ze轉zhuan變bian成cheng氨an，氮dan進jin一yi步bu與yu硫liu酸suan作zuo用yong生sheng成cheng硫liu酸suan銨an。由you大da分fen子zi分fen解jie成cheng小xiao分fen子zi的de過guo程cheng通tong常chang稱cheng為wei”消化”。為了加速消化，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高消化液的沸點(290℃→400℃)，加入硫酸銅作為催化劑，過氧化氫作為氧化劑，以促進反應的進行。

反應(1)(2)在凱氏燒瓶內完成

，反應(3)在凱氏蒸餾裝置中進行

，其特點是將蒸汽發生器
、蒸(zheng)餾(liu)器(qi)及(ji)冷(leng)凝(ning)器(qi)三(san)個(ge)部(bu)分(fen)融(rong)為(wei)一(yi)體(ti)。由(you)於(yu)蒸(zheng)汽(qi)發(fa)生(sheng)器(qi)體(ti)積(ji)小(xiao)，節(jie)省(sheng)能(neng)源(yuan)，本(ben)儀(yi)器(qi)使(shi)用(yong)方(fang)便(bian)，效(xiao)果(guo)良(liang)好(hao)。硫(liu)酸(suan)銨(an)與(yu)濃(nong)堿(jian)作(zuo)用(yong)可(ke)遊(you)離(li)出(chu)氨(an)
，借(jie)水(shui)蒸(zheng)氣(qi)將(jiang)產(chan)生(sheng)的(de)氨(an)蒸(zheng)餾(liu)到(dao)一(yi)定(ding)濃(nong)度(du)的(de)硼(peng)酸(suan)溶(rong)液(ye)中(zhong)，硼(peng)酸(suan)吸(xi)收(shou)氨(an)後(hou)使(shi)溶(rong)液(ye)中(zhong)的(de)H+濃度降低，然後用標準無機酸滴定，直至恢複溶液中原來H+濃度為止，最後根據所用標準酸的量計算出待測物中總氮量。

三
、儀器和試劑

儀器：消化管或凱氏燒瓶、凱氏定氮蒸餾裝置、電爐、消化爐
、100mL 錐形瓶、100mL 量筒、表麵皿、酸式滴定管、小漏鬥、玻璃珠等。

試劑

1. 血清或卵清蛋白等其他含蛋白質樣品

2. 消化液：30%過氧化氫、硫酸與水的比例為3∶2∶1
，臨用時配製。

3. 催化劑：硫酸銅(CuSO4•5H2O)與硫酸鉀(K2SO4)以1：3配比研磨混合。

4. 50%氫氧化鈉溶液

5. 2%硼酸溶液

6. 標準鹽酸溶液(約0.01mol/L)

7. 混合指示劑(田氏指示劑)混合指示劑由50mL 0.1%甲烯藍乙醇溶液與200mL0.1%甲基紅乙醇溶液混合配成貯於棕色瓶中配用。這種指示劑酸性時為紫紅色，堿性時為綠色，變色範圍很窄且很靈敏。

 

四、實驗步驟

(一)安裝微量凱氏定氮儀

定氮儀由蒸汽發生器
、反應室、冷凝管三部分組成。蒸汽發生器包括一個電爐及一個3～5升sheng容rong積ji的de燒shao瓶ping。反fan應ying室shi上shang邊bian有you兩liang個ge小xiao燒shao杯bei，一yi個ge供gong加jia樣yang，一yi個ge盛sheng放fang堿jian液ye。樣yang品pin和he堿jian液ye由you此ci可ke直zhi接jie到dao反fan應ying室shi中zhong。反fan應ying室shi中zhong心xin有you一yi長chang玻bo璃li管guan，其qi上shang端duan通tong到dao反fan應ying室shi外wai層ceng，下xia端duan靠kao近jin反fan應ying室shi的de底di部bu。反fan應ying室shi下xia端duan底di部bu有you一yi開kai口kou，上shang有you橡xiang皮pi管guan和he管guan夾jia。由you此ci放fang出chu反fan應ying廢fei液ye。反fan應ying所suo產chan生sheng的de氮dan可ke通tong過guo反fan應ying室shi上shang端duan細xi管guan經jing冷leng凝ning管guan通tong入ru收shou集ji瓶ping中zhong。反fan應ying室shi與yu冷leng凝ning管guan之zhi間jian由you橡xiang皮pi管guan相xiang連lian。

安裝儀器時
，將蒸汽發生器垂直地固定在鐵架台上
，用橡皮管把蒸汽發生器

、反應室
、lengningguanlianjieqilai。xiangpiguanlianjiedebuweiyingzaitongyishuipingweizhi。lengningguanxiaduanyushiyantaidejuliyifangdexiashoujipingweizhun。anzhuangwanbihou，budeqingyiyidong，yimianyiqisunhuai。yaorenzhenjianzhazhenggezhuangzhishifoulouqi
，yibaozhengsuocejieguodezhunquexing。

(二)樣品的處理

(1)固體樣品 隨機取一定量研磨細的樣品放入恒重的稱量瓶中，置於105℃的烘箱中幹燥4h，用坩堝鉗將稱量瓶取出放入幹燥器內，待降至室溫後稱重，隨後繼續幹燥樣品
，每幹燥1h，稱重一次，恒0重即可。

(2)血清樣品 取人血(或豬血)放入離心管中
，與冰箱中放置過夜。次日離心除去血凝塊，上層透明清液，即為血清。吸出1mL 血清加到50mL 容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，混勻備用。溶液如果顯混濁，加少量氯化鈉再混勻。

(3)卵清蛋白 取2g 卵清蛋白溶於0.9%NaCl 溶液並稀釋至100mL。如有不溶物，離心取上清液備用。

(三)消化

取5支消化管並編號，在1、2、3號管中各加入精確稱取幹燥樣品(注意：加樣品時應直接送入管底
，避免沾到管口和管頸上)，加催化劑0.5g
，混和消化液3mL，在4
、5號管中各加相同量的催化劑和混合消化液(若樣品是液體時
，還要加與樣品等體積的蒸餾水)作為對照，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質。搖勻後
，將5支zhi消xiao化hua管guan放fang在zai通tong風feng廚chu內nei的de遠yuan紅hong外wai消xiao煮zhu爐lu上shang消xiao化hua。先xian用yong小xiao火huo加jia熱re煮zhu沸fei，不bu久jiu看kan到dao消xiao化hua管guan內nei物wu質zhi變bian黑hei，並bing產chan生sheng大da量liang泡pao沫mo，此ci時shi要yao特te別bie注zhu意yi
，不bu能neng讓rang黑hei色se物wu質zhi上shang升sheng到dao消xiao化hua管guan的de頸jing部bu
，否fou則ze將jiang嚴yan重zhong地di影ying響xiang樣yang品pin測ce定ding結jie果guo。當dang混hun合he物wu停ting止zhi冒mao泡pao
，蒸zheng汽qi與yu二er氧yang化hua碳tan也ye均jun勻yun地di放fang出chu時shi，適shi當dang加jia強qiang火huo力li。在zai消xiao化hua時shi
，應ying是shi全quan部bu樣yang品pin都dou浸jin泡pao在zai消xiao化hua液ye中zhong，如ru在zai瓶ping頸jing上shang發fa現xian有you黑hei色se顆ke粒li，應ying小xiao心xin地di將jiang消xiao化hua傾qing斜xie振zhen搖yao，用yong消xiao化hua液ye將jiang它ta衝chong洗xi下xia來lai。通tong常chang消xiao化hua需xu要yao1～3h(對於那些賴氨酸含量較高的樣品需要更長的時間)。待消化液變成褐色後

，為了加速消化完成，可將消化管取出，稍冷
，加30%過氧化氫溶液1～2滴於管底消化液中
，再繼續加熱0.5h。消化完畢，取出消化管冷卻至室溫。

(四)蒸餾

(1)儀器的洗滌 儀器應先經一般洗滌，再經水蒸氣洗滌。目的在於洗去冷凝管中可能殘留的氨。對於處於使用狀態的儀器(正在測定中的儀器)加樣前使蒸汽通過1～2min 即可
，對於較長時間未使用的儀器，必須用水蒸氣洗滌到吸收蒸汽的硼酸―指示劑混合液中指示劑的顏色合格為止。洗滌方法如下：

取2～3個100mL 錐形瓶，加入10mL 2%硼酸
、2滴混合指示劑

，用表麵皿覆蓋備用。現煮沸蒸汽發生器
，其中盛有2/3體積的用幾滴硫酸酸化過的蒸餾水
，樣品杯中也加入2/3tijizhengliushuijinxingshuifeng。guanbijiazishizhengqitongguofanyingshizhongdechaguanjinrufanyingshi
，zaiyoulengningguanxiaduanyichu。zailengningguanxiaduanfangyikongshaobeiyichengshouningjishuidi。zheyangyongzhengqixidi5min 左右，在冷凝管下口放一個準備好的盛有硼酸―指示劑的錐形瓶
，位置傾斜
，冷凝管下口應完全浸泡於液體內，繼續用蒸汽洗滌1～2min，觀察錐形瓶中的溶液是否基本上不變色，若不變色，則證明蒸餾器內部已洗滌幹淨。下移錐形瓶，使硼酸液麵離開冷凝管口約1cm，繼續通蒸汽1min。最後用蒸餾水衝洗冷凝管外口
，排廢開始。用右手輕提樣品杯中棒狀玻塞，

使水流入反應室的同時
，立即用左手關閉夾子，蓋好玻塞。由於反應室外層中蒸汽冷縮、壓力降低，反應室內廢液通過反應室中插管自動抽到反應室外殼中
，再在樣品杯中加入2/3體積蒸餾水，如此反複三次既可排盡廢液及洗滌液。打開夾子將反應室外殼中積存的廢液排出，關閉夾子再使蒸汽通過全套蒸餾儀1~3min，可進行下一次蒸餾。

(2)樣品及空白的蒸餾 取5個100mL 錐形瓶，分別加入2%硼酸10mL，混合指示劑2滴，溶液呈紫紅色
，用表麵皿覆蓋備用。

把消化管中的消化液全部轉移到樣品杯中，用約2mL 蒸餾水衝洗消化管，重複3ci
，baxidiyedoudaoruyangpinbeizhong
，dakaiyangpinbeidebangzhuangbosai，jiangyangpinfangrufanyingshi
，yongshaoliangzhengliushuichongxiyangpinbeihouyeshizhiliurufanyingshi，gaishangbosai，bingzaiyangpinbeizhongjiayue2/3體積的蒸餾水進行水封。而後將裝有硼酸―指示劑的錐形瓶放在冷凝管口下方，打開存放堿液杯下端的夾子，放10mL40%氫氧化鈉溶液於反應室後，立即上提錐形瓶，使冷凝管下口浸沒在錐形瓶的液麵下。反應液沸騰後，錐形瓶中的硼酸―指示劑混合液由紫紅色變為綠色，自變色時開始計時
，蒸餾3～5min。移動錐形瓶，使硼酸液麵離開約1cm
，並用少量蒸餾水衝洗冷凝管下口外麵，繼續蒸餾1min
，用yong少shao量liang蒸zheng餾liu水shui衝chong洗xi冷leng凝ning管guan下xia端duan尖jian嘴zui，將jiang錐zhui形xing瓶ping取qu出chu，用yong表biao麵mian皿min覆fu蓋gai以yi待dai滴di定ding。排pai液ye和he洗xi滌di等deng操cao作zuo與yu前qian麵mian相xiang同tong。排pai廢fei洗xi滌di後hou，可ke進jin行xing下xia一yi個ge樣yang品pin的de蒸zheng餾liu(每一個樣品要同時做三份，以求得準確結果)。待樣品和空白消化液蒸餾完畢後，同時進行滴定。

(五)滴定

全部蒸餾完畢後

，用0.001mol/L 標準鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集的氨量，直至硼酸―指示劑混合液由綠色變回淡葡萄紫色，即為滴定終點，記錄所耗HCl 溶液量。

五
、計算

樣品的總氮含量(%)=(A―B)×0.001×14.008×100/1000×C

若測定的樣品含氮部分隻是蛋白質(如血清)，則：

樣品中的蛋白質含量(%)=(A－B)×0.001×14×6.25×100/1000×C

A－滴定樣品用去的鹽酸體積(mL)
；

B－滴定空白用去的鹽酸體積(mL)；

C－稱量樣品的量(g)

；

0.001－鹽酸的摩爾濃度(mol/L)
；

14－氮原子量
；

6.25－係數(1mL0.001mol/L 鹽酸相當於0.14mg 氮)。

若樣品中除有蛋白質外
，尚有其它含氮物質
，則樣品蛋白質含量的測定要複雜一些。首先，需向樣品中加入三氯乙酸
，使其最終濃度為5%，然ran後hou測ce定ding未wei加jia入ru三san氯lv乙yi酸suan的de樣yang品pin及ji加jia入ru三san氯lv乙yi酸suan後hou樣yang品pin的de上shang清qing液ye中zhong的de含han氮dan量liang
，得de出chu非fei蛋dan白bai氮dan量liang，從cong而er計ji算suan出chu蛋dan白bai氮dan，再zai進jin一yi步bu折zhe算suan出chu蛋dan白bai質zhi含han量liang。

蛋白氮=總氮－非蛋白氮

粗蛋白質含量(%)=蛋白氮×6.25